乳铁蛋白
乳铁蛋白（lactoferrin）属于转铁蛋白中的一种，是一种非血红素铁结合的糖蛋白。乳铁蛋白主要产生于哺乳动物的体内腺上皮细胞和中性粒细胞，并广泛存在于哺乳动物的生物体液中，具有转运和储存铁离子、抗菌抗病毒和调节免疫系统的作用。常用的提取乳铁蛋白的方法以盐析法、透析法、超滤法、色谱法和磁分离法为主；检测乳铁蛋白的方法有理化分析法、免疫分析法和生物电化学法等。乳铁蛋白的多种活性功能使得其在食品、化妆品、医药和畜牧养殖等领域都有着诸多应用。
发现历史
1939年，丹麦科学家索伦森（Sorensen）等人在分离牛奶中的乳清蛋白时首先找到这种新型蛋白质。因这种蛋白呈红色，被称为“牛奶的红色部分”（the red fraction of milk）。1960年，瑞典科学家约翰逊（Johanson）等人从人乳中分离出该种蛋白；次年，法国科学家布兰克（Blanc）等人再次分离提纯得到这种蛋白，并将其命名为“乳铁蛋白”。
分布情况
乳铁蛋白主要由哺乳动物黏膜上皮细胞合成和分泌产生，广泛存在于真皮黏膜、中性粒细胞和外分泌物（如眼泪、唾液、精液等）等大部分的生物体液中。
人体组织分泌液中乳铁蛋白含量如下：
物质结构
分子结构
乳铁蛋白是由约七百多个氨基酸组成的，带有生物功能机制的一条多肽链。该链的三维立体结构由两个高度同源、结构类似的叶片长链绞合而成（N-叶和C-叶）。N-叶和C-叶结构各自包含了氨基酸1~332和氨基酸344~703，双叶在链区进行结构连接，且质量大小均衡。N-叶和C-叶内部结构经过α-螺旋和β-折叠聚合后进一步分成N1、N2结构域和C1、C2结构域。C-叶比N-叶所携带的正电荷更少。经研究表明，N-叶结构是提高乳铁蛋白抗菌活性相关结构，而C-叶结构则对一些疾病的治疗有所裨益。
乳铁蛋白有两个金属离子的结合位点，每个位点含有一个天门冬氨酸、一个组氨酸的生物合成和两个酪氨酸。因此，它能够可逆性结合一个Fe³⁺离子和一个CO₃²⁻离子。因其与铁离子的配位化合物显红色，故而乳铁蛋白也有“红蛋白”之称。
聚合形式
乳铁蛋白在生物体液中主要以单体形式和聚合形式存在。其聚合形式是归因于钙依赖性的自聚合，可分为二聚体形式、三聚体形式和四聚体形式，其中四聚体是最主要的形式。
理化性质
表面带有正电荷
乳铁蛋白表面带有正电荷是其重要的特性之一，这一特性可以驱使乳铁蛋白与阴离子化合物相结合。乳铁蛋白表面带正电荷的部位分布在两处位置，第一处是在瓣间区域间具有正电荷的斑点上，第二处是在N1结构域中第一个α-螺旋的两个区域。
铁结合性能
转铁蛋白和乳铁蛋白是哺乳动物体内最主要的两种运铁蛋白，可以与铁相结合，但前者的亲铁能力仅为后者的0.33%~0.40%。根据乳铁蛋白结合的铁离子数量的不同，可以将其分为三种类型：铁饱和乳铁蛋白、半饱和乳铁蛋白和饱和脱铁乳铁蛋白。
稳定性
乳铁蛋白具有良好的稳定性，主要体现在短时间内不受温度影响。研究发现，72 ℃或135 ℃下短时间保温（8~20 s），其的铁结合能力基本不受影响；但进行较长时间保温处理时，则铁结合能力有所下降。
热变性
乳铁蛋白的热变性的强弱程度取决于与铁离子的结合程度。其中饱和乳铁蛋白热变性温度最高，脱铁乳铁蛋白热变性温度最低。进一步研究显示，乳铁蛋白不仅可以与铁离子结合，还可以与铜、锰、锌等离子结合。
生物学功能
抗微生物作用
抗菌性
抵御病菌侵袭的防御体系中，抗菌蛋白和抗菌肽是首道防线。作为抗菌蛋白的一种，乳铁蛋白拥有优秀的铁结合能力，使之能够抑制细菌生长，干扰其形成细胞膜，进而产生阻挠细菌粘附、拦截细菌进入细胞的作用。乳铁蛋白还能产生的携带正电的抗菌肽，能中和携带负电的磷酸甘油酯和脂多糖，使病原菌的细胞膜物质透过种类和流速发生改变，致使其生理功能遭受破坏，产生抑菌效果。
乳铁蛋白还能对肠道菌群进行调控。在婴幼儿配方乳粉中添加乳铁蛋白，能促进婴幼儿肠胃功能强化，提高免疫力。乳铁蛋白能产生具有抗菌活性的多肽，但是受到环境pH值变化的影响，从而影响乳铁蛋白的抑菌作用，并且影响程度与细菌的种类有关。对于革兰阳性菌，pH值的变化使乳铁蛋白对其的抑制作用受到较大影响，当pH值为7.5~8.0时抑菌效果最佳。此外，乳铁蛋白经过70 ℃以下的巴氏杀菌后抑菌活性基本不受影响，而且HCO³⁻浓度的增加会有助于增强其抑菌性。
乳铁蛋白（LF）抑菌作用机制如下：
抗真菌、寄生虫作用
已知乳铁蛋白能与多种病原菌发生作用。铁作为生物体不可或缺的元素，参与多种重要的生命活动。病原微生物同样需要摄取铁元素。乳铁蛋白优异的铁结合能力，能参与竞争微生物的铁源，促进机体对病原微生物的防御能力。乳铁蛋白抵御病原微生物的机制有多种，包括抑制生物被膜形成、抑制病毒复制、粘附于病原微生物等。
乳铁蛋白（LF）抑真菌和寄生虫作用机制如下：
抗病毒作用
乳铁蛋白及其功能肽在抗病毒方面同样发挥重大作用。通过对包病毒或裸病毒包围封闭，乳铁蛋白和其功能肽可以阻止二者进入细胞内。而乳铁蛋白也可以通过直接附着于病毒颗粒上，抑制病毒对细胞的侵入。
乳铁蛋白作为转铁蛋白族的成员，也是防御致病细菌的主要成员，也已证明对多种病毒具有克制力。其中就含有人类疱疹病毒、腺病毒科、轮状病毒以及小儿麻痺症病毒等，对生物医学与人类免疫研究都有着重大价值。
乳铁蛋白（LF）抗病毒作用机制如下：
抗炎和免疫调节作用
抗炎活性
初始炎症阶段，乳铁蛋白直接促使肉芽组织的形成和再上皮化，促进皮肤的伤口愈合，表现出其抗炎活性。通过刺激引起成纤维细胞与角质细胞发生增殖并迁移到伤口处，乳铁蛋白能够促使细胞外基质成分的合成，并且可以有效地清除发炎过程中的铁离子和自由基，从而达到抗炎的目的。
免疫调节活性
在免疫过程中，乳铁蛋白结合入侵细菌的表面受体，控制其对机体细胞的侵袭。通过直接螯合铁，同样可以达到调节主要的铁相关蛋白，起到铁清除剂的效果。
乳铁蛋白兼具对免疫系统的刺激与调控。乳铁蛋白是先天性免疫系统的重要组成部分。当革兰氏阴性菌进入宿主后，微生物就会暴露在免疫系统的多种蛋白面前。在其细胞壁上产生的细菌脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS），是许多噬菌体在细菌表面的吸附受体。革兰氏阴性菌释放的LPS会与多种结合分子相互作用，发挥免疫刺激作用。乳铁蛋白是高亲和力LPS结合的候选蛋白之一。
乳铁蛋白能活化巨噬细胞的细胞因子，刺激B、T淋巴细胞，催熟未熟的树突状细胞，从而增强三者刺激抗原特异性T细胞的能力。
酶活性
由于乳铁蛋白的部分序列与核糖核酸酶的序列的相似度很高，因此乳铁蛋白还能在反应中充当酶的角色，起到催化作用，但是其酶活性受到铁结合量的影响。
促铁转运作用
乳铁蛋白承担着运输生物体内铁离子的重任。通过负反馈的调控机制，当细胞内缺乏铁时，细胞的表面会增加乳铁蛋白的特异性受体，增加与乳铁蛋白的结合量。
促进骨的生长活性作用
乳铁蛋白对骨的生长活性作用主要体现在以下两点：对成骨细胞来说，其有强效的增殖和抗凋亡作用；对破骨细胞来说，其会产生抑制的作用。
提取方法
盐析法
盐析法是根据蛋白质在不同浓度的盐溶液中的溶解度不同，利用高浓度盐溶液降低蛋白质的溶解度，从而达到析出蛋白质的目的。该方法的优点是操作简单，不需要购置价格高昂的仪器，且盐析过程可逆，不易引起乳铁蛋白变性；缺点是提取得到的纯度较低。有研究人员通过调节硫酸盐溶液的饱和度和pH值，成功用该方法实现了对乳铁蛋白进行粗提取。
透析法
透析法是利用溶液中不同分子大小的物质，对半透膜的通过情况不同从而分离不同分子大小的物质的方法。当采用先盐析后透析的方法后，能从牛初乳中提取出纯度高达92%的乳铁蛋白。
超滤法
超滤法是根据不同大小的膜孔径可以过滤不同分子量大小的物质，从而进行物质分离。作为工业上最常用的提取蛋白质的方法之一，超滤法操作简单方便，只是同样提取纯度有限，且需要定期对超滤膜进行清洗，防止堵塞。有研究表明，该方法能将甜乳清浓缩将近十倍。
色谱法
色谱法有离子交换色谱、亲和色谱和膨胀床色谱等方法。
离子交换色谱介质应根据离子交换强度与特异性、机械阻力、清洁程度和化学稳定性来筛选。使用该方法时，阳离子交换树脂同时捕捉乳铁蛋白和乳过氧化物酶，然后通过盐梯度或pH梯度洗脱树脂实现二者的分离，制备纯度高达95%以上的乳铁蛋白。
亲和色谱是利用固定相的结合特性来吸附靶蛋白。如使用不含氯化钠结合缓冲液的MEP树脂柱进行层，乳铁蛋白的回收率可高达91%。
膨胀床色谱技术是一种生物分离技术。正确选择吸附剂和确定洗脱条件是该技术的关键点。通过直接从粗原料或黏性溶液中捕获靶蛋白，膨胀床色谱技术具有分离效率高、处理量大、运行成本低、可连续操作等特点，是可用于乳铁蛋白工业化分离纯化的新型技术。
磁分离法
磁性聚合物微球是一种能对外加磁场做出响应、具有常规聚合物微球的诸多性质的磁性微球。当介于外加磁场内时，磁性聚合物微球能快速从介质中分离出来。运用这种原理，磁分离法成为蛋白质分离和富集技术领域中一种高效的方法。科学家利用磁分离技术不仅开发出了能自动化分离牛乳清中乳铁蛋白的纯化系统，也可以通过制备出微米级的磁性亲和剂提纯得到超高纯度乳铁蛋白，还可以通过制备特殊磁性纳米颗粒成功完成对乳铁蛋白的快速吸附的。磁分离法对乳铁蛋白的提取具有巨大的实践意义。
应用现状
食品领域
利用乳铁蛋白的抑菌原理，可将其作为食品中的天然保鲜剂。此外，乳铁蛋白还是酸奶、脱脂乳、保健食品以及发酵乳制品等众多产品的主要成分之一。同时，因母乳中含有较多的乳铁蛋白，在婴幼儿的奶粉配方中人为添加，可以使奶粉成分更接近母乳，促进婴儿的铁吸收，更进一步提高婴幼儿的抵抗力，预防败血症的发生。
化妆品领域
除了抗炎、抗菌以外，研究表明乳铁蛋白还可以通过促进人体胶原蛋白的形成和抑制黑色素的生成，因此在化妆品领域，乳铁蛋白可作为安全的皮肤美白剂广泛添加于各类产品中。
医药领域
利用乳铁蛋白抗菌、消炎、抗病毒的功能，可将其用于口腔治疗、微生物感染的预防和治疗。此外，还可用于防止婴儿胃肠道感染，降低新生儿坏死性小肠结肠炎，辅助治疗干眼症，甚至是防治神经退行性疾病等。
畜牧业领域
乳铁蛋白可以作为营养强化剂，添加到动物的饲料当中，提高动物的生长性能和免疫力。由于无毒和无副作用，乳铁蛋白是一种绿色健康的饲料添加剂。
检测方法
理化分析法
反相高效液相色谱法
根据在色谱柱中分配系数与吸附力大小的不同，进行各组分的分离和检测的方法是高效液相色谱法（HPLC）。其中反相高效液相色谱（RP-HPLC）的应用当属该方法中最广为人知的一种。该方法的操作过程简便，检测快速，但对样品的纯度要求较高。若待测样品纯度较低，不同物质分子在色谱柱上保留时间相似，位置相近，不易分离，影响定量结果。因此HPLC适用于高纯度的样品测定。
高效毛细管电泳分析法
高效毛细管电泳分析法（HPCE）利用毛细管的分离柱效与样品分子的扩散系数成反比的特性，可以用来分析具有扩散系数小的优势特点的蛋白质。用该方法具有前处理简单、成本优势、操作方便等优点，但由于前处理中难以取出其他杂质的影响，通常只能用于保健乳品中的乳铁蛋白含量测定。
聚丙烯酰胺凝胶电泳法
聚丙烯酰胺凝胶电泳技术常用来做蛋白质和多肽的分离。利用不同分子所携带电荷和分子质量的差异，形成不同的电子迁移速率，把蛋白质区分出不同的区带。该方法分离乳铁蛋白效果较好。该方法测定乳铁蛋白含量准确度、重复性较好，不需要繁杂的前处理过程，敏感度高，不需要使用大量溶剂，但每次处理的样本总量有限，使用凝胶、电泳和染色脱色所需的时间较长。
分光光度法
分光光度法（Spectrophotometry）是利用一定的波长区间内，不同物质的吸光度不同进行物质测定的方法。分光光度法具有快速、简便、经济，对仪器的要求不高，适合于工厂中乳铁蛋白的快速检测。但该方法的精度有限，不适用乳制品中乳铁蛋白含量的精确测定。
免疫分析法
放射免疫扩散法
放射免疫扩散法（Radial Immunodiffusion）是结合同位素标记的方法，研究机体对抗原结合物质发生反应的进展和变化的技术。该办法虽然操作简单，但耗时良久，且影响因素多，范围狭窄。只适合于婴幼儿配方乳粉的检测。实际运用中测定乳铁蛋白含量时，放射免疫扩散法往往被其他更快速、便捷的方法所取代。
酶联免疫吸附法
酶联免疫吸附法（ELISA）是同时融合了抗原抗体的特异性反应与蛋白质催化反应的一项新免疫学研究方法。酶联免疫法的优势是能够同时众多试样进行检测，但在实际操作中，酶联免疫吸附法需对样品进行逐级稀释。这个过程中不排除操作不当可能会产生误差。但相较于其他的检测技术而言，酶联免疫吸附法依然是相对理想的乳铁蛋白测定法。
胶体金标记法
利用还原剂将氯金酸聚合成大小一定的金颗粒，形成带负电的胶溶液。在静电场中该胶体能稳定存在，故叫做胶体金。胶体金标记是蛋白质等有机高分子化合物被吸附于胶体金颗粒表面的包被过程。将抗乳铁蛋白抗体标记在胶体金粒子表面，形成金探针，金探针与乳血清铁蛋白进行特异性结合，特异性结合产物可用分光光度计进行检测。胶体金法标记对象较少，能大程度地减少分析用时，但其敏感度和测定限容易被外部原因所影响。
生物电化学法
循环伏安法（cyclic 伏安法，CV）是常用的电化学技术。记录循环伏安曲线图像，即可进行物质分析。交流阻抗法（Electrochemical Impedance Spectroscopic）是一种通过对微变正弦波扰动电解池后电极参数变化的计算，来定量检测物质的方法。循环伏安法的优势是检测限低，测量灵敏，精确度高，其缺点是易受外部环境因素影响试验结果，要求由专门技术人员加以使用。
参考资料
National Center for Biotechnology Information， PubChem Compound Summary for CID 126456119, Lactoferrin.pubchem.ncbi.2023-03-16